PCR的工作機(jī)制

　　PCR由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包含前、中、后三個(gè)階段。最重要的化學(xué)變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會(huì)改變，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài)。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開始。當(dāng)溫度較低時(shí)，引物退火到模板上。

　　早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標(biāo)。在中期的循環(huán)中，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板。最后幾個(gè)循環(huán)中，增擴(kuò)后的高濃度產(chǎn)物互相雜交，由此阻止與引物的雜交。

　　引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應(yīng)都會(huì)造成產(chǎn)物擴(kuò)展，它們的特異性在最初的幾個(gè)循環(huán)中可能很難控制，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過在模板上正確退火位置的量。PCR反應(yīng)特異性的可靠度依賴于2個(gè)引物必須定位到互補(bǔ)的DNA鏈上。進(jìn)一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應(yīng)小于10kb。

　　相比之下，增擴(kuò)階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴(kuò)的片段區(qū)分開。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個(gè)循環(huán)的嚴(yán)密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡單的，增擴(kuò)期間由染色體DNA貢獻(xiàn)的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分。甄選的復(fù)雜性被超量由引物從互補(bǔ)位點(diǎn)新增擴(kuò)的片段所降低。

　　PCR的化學(xué)計(jì)量

　　熱力學(xué)方面的影響對(duì)PCR來講是試劑濃度和模板間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低。令人驚訝的是這種減低是由增擴(kuò)的目標(biāo)分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應(yīng)結(jié)束后，dNTP的濃度下降超過1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶沒有變化。增擴(kuò)千萬倍目標(biāo)分子后，模板分子遠(yuǎn)多于酶分子。當(dāng)產(chǎn)物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動(dòng)自身退火。當(dāng)自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有限時(shí)，反應(yīng)處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級(jí)的增長。增擴(kuò)階段是自我受限的。這個(gè)階段之后，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個(gè)循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標(biāo)增擴(kuò)，盡管能夠通過提高開始時(shí)Taq DNA聚合酶和引物的含量來維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性因?yàn)橐�物�?huì)胡亂雜交，出現(xiàn)額外的條帶和斑點(diǎn)。

　　熱啟動(dòng)(hot start)PCR

　　用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR對(duì)提高PCR特異性尤為有效。 盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在PCR配制過程中，熱循環(huán)剛開始，以及保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。

　　限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，無法完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動(dòng)通過抑制DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。方法包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時(shí)，暫停并保持溫度在70度以上。手工加入聚合酶，這個(gè)方法過于煩瑣， 尤其是對(duì)高通量應(yīng)用容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分如鎂離子、酶、模板、緩沖液包裹起來，物理地分隔開。熱循環(huán)開始后，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。蠟防護(hù)層法與手動(dòng)熱啟動(dòng)法一樣比較煩瑣，易受污染，不適用于高通量應(yīng)用。

　　還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

　　Booster PCR

　　整個(gè)PCR反應(yīng)過程中引物前后擔(dān)任2種功能，篩選探針和增擴(kuò)引導(dǎo)。在最初的幾個(gè)熱循環(huán)期間，每個(gè)引物作為探針獨(dú)立地活動(dòng)，篩選所有目標(biāo)。如果一對(duì)引物與目標(biāo)雜交，方向和位置都正確，就意味著目標(biāo)選擇的工作完成了。接下來在以后的循環(huán)中這對(duì)引物引導(dǎo)增擴(kuò)反應(yīng)。

　　增擴(kuò)低濃度的模板(等于或小于100個(gè)模板)比如單個(gè)細(xì)胞，石蠟化的組織有不同的特點(diǎn)。篩選階段相對(duì)于模板而言要有更多剩余的試劑。稀釋的模板造成難以篩選，因?yàn)橐�物和模板相遇和頻率被大大的降低了。這種情況更有可能引起引物之間形成二聚體。Booster PCR是解決這個(gè)問題的方法。在此步驟中，第一個(gè)循環(huán)階段使用稀釋后的引物和模板取得固定的引物/模板比例，大約在107:1。以確保開始擴(kuò)增時(shí)的準(zhǔn)確性，在增擴(kuò)階段提高引物的濃度到正常水品。

　　嵌套的引物

　　如果增擴(kuò)出的DNA序列嵌套存在于引物退火位置之間，從大范圍看增擴(kuò)出的目標(biāo)是同源的。引物雜交的嚴(yán)密性在最初若干個(gè)循環(huán)里是寬松的，允許較高的錯(cuò)配偏差。這個(gè)效果能通過低于計(jì)算得到引物退火溫度來達(dá)到。第二步選擇明確的產(chǎn)物，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡x擇一條已知染色體片段用來增擴(kuò)。簡單點(diǎn)說就是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物, 一對(duì)是長的，另一對(duì)短的是包含在長引物內(nèi)的，用長引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板，這樣可以增加產(chǎn)物的量而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況.

　　假陰性

　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

　　模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

　　酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因?yàn)槊傅幕钚詥适Щ虿粔蚨鴮?dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)PCR時(shí)忘了加Taq酶或電泳時(shí)忘了加溴化乙錠。

　　引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

　　假陽性

　　引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

　　靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

　　出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

　　PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次，是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)，重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸，也叫兩步法)。

　　出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

　　PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶的量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)